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詳解PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理
  • 發(fā)布日期:2022-10-24      瀏覽次數(shù):1736
    • 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一項(xiàng)利用 DNA 雙鏈復(fù)制原理,在生物體外復(fù)制特定 DNA 片段的的核酸合成技術(shù)??稍诙虝r(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的 DNA 片段,而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。

      DNA 的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈 DNA 在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在 DNA 聚合酶的參與下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),DNA 在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈,當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制 DNA 的變性和復(fù)性,加入設(shè)計(jì)引物,DNA 聚合酶,dNTP 就可以完成特定基因的體外復(fù)制,這是 PCR 的理論基礎(chǔ)。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。

      PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:
      1、模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備;

      2、模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合;
       3、引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

          重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘, 2~3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍


         



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