ELISA測(cè)定現(xiàn)通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測(cè)定模式，測(cè)定操作非常簡(jiǎn)單，一般涉及到標(biāo)本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果判斷和結(jié)果報(bào)告及解釋等方面，其中任一步驟的不當(dāng)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。現(xiàn)分述ELISA常見問題與解決方法：
1. 陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果
① 樣品、試劑被污染，或加樣時(shí)操作不當(dāng)導(dǎo)致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑，小心操作。
② 酶標(biāo)板洗滌不*——洗板前先將抗體溶液倒干凈，然后清洗液倒?jié)M板孔，確保能充分洗滌。
③ 抗體量過多導(dǎo)致非特異性結(jié)合——根據(jù)說明書的推薦量使用抗體，稀釋抗體到適當(dāng)濃度。
2．酶標(biāo)板整體背景高
① 抗體非特異性結(jié)合——應(yīng)確保板孔進(jìn)行了封閉并且使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液以防止非特異性結(jié)合。
② 底物結(jié)合濃度過高——對(duì)底物進(jìn)行適當(dāng)稀釋。
③ 反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)——當(dāng)酶標(biāo)板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀數(shù)時(shí)立即使用終止液終止反應(yīng)，適當(dāng)縮短顯色時(shí)間。
④ 底物溶液污染——正常底物溶液應(yīng)是澄清透明的，若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染，應(yīng)更換新的底物溶液。
⑤ 底物孵育過程沒有避光——底物孵育應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。
3. 復(fù)孔之間重復(fù)性差
① 樣品數(shù)量不整齊，加樣時(shí)間有長(zhǎng)有短——加重復(fù)孔時(shí)盡量保持加樣時(shí)間與第一次接近。
② 加樣量不一致——樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，并且使用同一移液槍。
③ 洗滌條件、操作人員不一致——重復(fù)測(cè)定樣品時(shí)，操作條件、人員應(yīng)盡可能與上次保持一致。
4. 吸光值偏高或偏低
① 樣品中待測(cè)抗原含量太低會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低——可嘗試增加樣品使用量。
② 加入抗體量不合適會(huì)造成結(jié)果偏低或偏高——使用建議抗體量或?yàn)榱耸菇Y(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的適用量。
③ 孵育時(shí)間太短導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低——適當(dāng)延長(zhǎng)抗體或抗原的孵育時(shí)間，確保待測(cè)樣品與檢測(cè)抗體能充分結(jié)合。
④ 孵育溫度不適合——應(yīng)保證抗體在最適宜條件下進(jìn)行孵育（一般37℃孵育1h）。
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