酶ELISA試劑盒，即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒，是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用廣的技術(shù)。其基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，這種結(jié)合既不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。酶標(biāo)記抗體可以與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。在加入底物溶液后，底物在酶的作用下會(huì)使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，從而出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可以通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。
酶ELISA試劑盒是一種常用的生物檢測(cè)工具，主要用于定量或定性檢測(cè)樣本中的特定抗原或抗體。以下是其標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定步驟：
1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
試劑平衡：將試劑盒從冰箱取出，室溫平衡2030分鐘，避免溫差導(dǎo)致冷凝水影響結(jié)果。
樣本處理：根據(jù)說明書稀釋樣本（如血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清等），確保無溶血或污染。
器材準(zhǔn)備：預(yù)熱酶標(biāo)儀，準(zhǔn)備微量移液器、洗板機(jī)、吸水紙等。
2、包被（Coating）
向酶標(biāo)板孔中加入包被抗體（或抗原），4℃過夜孵育或按說明書要求條件進(jìn)行。
注意：避免氣泡產(chǎn)生，可用封板膜密封防止蒸發(fā)。
3、封閉（Blocking）
棄去包被液，用洗滌緩沖液（如PBST）洗板35次，拍干。
加入封閉液（如5脫脂奶粉或BSA），37℃孵育12小時(shí)，減少非特異性結(jié)合。
4、加樣與孵育
標(biāo)準(zhǔn)品：按梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣本：加入待測(cè)樣本，每孔設(shè)置復(fù)孔以減少誤差。
孵育：37℃孵育12小時(shí)（競(jìng)爭(zhēng)法可能時(shí)間不同）。
5、洗滌
棄去液體，用洗板機(jī)或手動(dòng)洗板35次，每次浸泡30秒，徹d去除未結(jié)合物質(zhì)。
6、加酶標(biāo)二抗
加入酶標(biāo)記的二抗（如HRP標(biāo)記），37℃孵育3060分鐘。
7、顯色反應(yīng)
加入底物溶液（如TMB），避光顯色1030分鐘（顏色變化需肉眼可見）。
終止：迅速加入終止液（如2M H?SO?），顏色由藍(lán)變黃。
8、讀數(shù)與分析
立即用酶標(biāo)儀在指定波長(zhǎng)（如450nm/630nm雙波長(zhǎng)）測(cè)定吸光度（OD值）。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度，或比較樣本與陰性對(duì)照的差異。
