酶ELISA試劑盒，即酶聯免疫吸附試驗試劑盒，是酶免疫測定技術中應用廣的技術。其基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，這種結合既不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。酶標記抗體可以與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結合。在加入底物溶液后，底物在酶的作用下會使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，從而出現顏色反應。因此，可以通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。
酶ELISA試劑盒是一種常用的生物檢測工具，主要用于定量或定性檢測樣本中的特定抗原或抗體。以下是其標準測定步驟：
1、實驗前準備
試劑平衡：將試劑盒從冰箱取出，室溫平衡2030分鐘，避免溫差導致冷凝水影響結果。
樣本處理：根據說明書稀釋樣本（如血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清等），確保無溶血或污染。
器材準備：預熱酶標儀，準備微量移液器、洗板機、吸水紙等。
2、包被（Coating）
向酶標板孔中加入包被抗體（或抗原），4℃過夜孵育或按說明書要求條件進行。
注意：避免氣泡產生，可用封板膜密封防止蒸發(fā)。
3、封閉（Blocking）
棄去包被液，用洗滌緩沖液（如PBST）洗板35次，拍干。
加入封閉液（如5脫脂奶粉或BSA），37℃孵育12小時，減少非特異性結合。
4、加樣與孵育
標準品：按梯度稀釋標準品，構建標準曲線。
樣本：加入待測樣本，每孔設置復孔以減少誤差。
孵育：37℃孵育12小時（競爭法可能時間不同）。
5、洗滌
棄去液體，用洗板機或手動洗板35次，每次浸泡30秒，徹d去除未結合物質。
6、加酶標二抗
加入酶標記的二抗（如HRP標記），37℃孵育3060分鐘。
7、顯色反應
加入底物溶液（如TMB），避光顯色1030分鐘（顏色變化需肉眼可見）。
終止：迅速加入終止液（如2M H?SO?），顏色由藍變黃。
8、讀數與分析
立即用酶標儀在指定波長（如450nm/630nm雙波長）測定吸光度（OD值）。
根據標準曲線計算樣本濃度，或比較樣本與陰性對照的差異。
