測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)有突變，主要考慮三個(gè)方面的原因：測序，PCR/克隆過程，引物本身。
1、測序引入的錯(cuò)誤
對于PCR產(chǎn)物進(jìn)行的克隆而言，無論是TA克隆或酶切克隆，引物區(qū)往往位于載體兩端，如果用載體引物進(jìn)行測序，此時(shí)克隆引物區(qū)離測序引物區(qū)的距離比較近，處于測序起始階段或正好處于測序染料峰所在的區(qū)域內(nèi)（90-120 bp），這兩個(gè)區(qū)域也是最容易產(chǎn)生測序錯(cuò)誤的地方。因此，首先要看原始的測序峰圖在引物區(qū)內(nèi)是否清晰，堿基的錯(cuò)誤或缺失是否是由于峰圖不清楚而導(dǎo)致的計(jì)算機(jī)誤讀。
2、PCR/克隆過程
盡管使用高保真聚合酶進(jìn)行PCR出錯(cuò)的可能性比較少，但不排除PCR錯(cuò)配或者克隆過程中突變的可能。有的人會問，PCR的突變怎么會出現(xiàn)在引物區(qū)呢？這是因?yàn)?，引物是單鏈?/span>PCR產(chǎn)物引物區(qū)的互補(bǔ)鏈同樣是以引物為模板進(jìn)行擴(kuò)增得到的，因此，有可能存在引物正確但其產(chǎn)物出錯(cuò)的情況。
針對這種情況的解決方法是進(jìn)行測序時(shí)，請送2-3個(gè)獨(dú)立的克隆子進(jìn)行測序，這樣可以排除PCR過程出錯(cuò)或克隆產(chǎn)生突變的情況。
3、引物本身錯(cuò)誤
如前面所述，引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應(yīng)，即使每一步合成效率達(dá)到99%，仍有1%的序列不能連接或錯(cuò)誤地連接下一個(gè)堿基，這些序列在經(jīng)過Capping后脫離循環(huán)，成為缺堿基的失敗序列；
對于缺失突變，一般認(rèn)為是一般認(rèn)為是帶帽(capping)反應(yīng)不*造成的，Caping反應(yīng)主要是封閉極少數(shù)5'-羥基沒有參加反應(yīng)單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時(shí)將不能繼續(xù)參與合成。對于實(shí)驗(yàn)中測序發(fā)現(xiàn)的較常見堿基缺失的可能原因如下：
1)、 由于DNA合成是沿著3'→5'端方向?qū)A基逐個(gè)連接上去的，每連上一 個(gè)堿基，都需要經(jīng)過 (Detritylation、Coupling、Capping、Oxidation)一個(gè)循環(huán)。Coupling是上一個(gè)堿基的5'-OH 與下一個(gè)堿基的3'活性部分發(fā)生反應(yīng)，該反應(yīng)的效率可達(dá)99%，即便如此，仍有1%的序列不能連接下一個(gè)堿基，這些序列在經(jīng)過Capping后脫離循環(huán)，成為缺堿基的失敗序列；
2）、 Capping是將沒有連接上下一個(gè)堿基的5'-OH乙?；?，Capping的效率不可能達(dá)到100%，沒有被乙酰化的5'OH會進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)，造成中間缺堿基的失敗序列；
3）、 Detritylation是脫掉上一個(gè)堿基5'-OH上的保護(hù)基，準(zhǔn)備連接下一個(gè)新堿基，Detritylation的效率也不可能達(dá)到100%，沒有脫保護(hù)的5'-OH會跳過該循環(huán)而直接進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)，造成中間缺堿基的失敗序列；
至于插入突變，引物序列中往往是堿基重復(fù)，一般認(rèn)為，偶連過程中，正在偶連的部分堿基發(fā)生丟失DMT，處于活性狀態(tài)的新堿基在沒有與上一個(gè)堿基反應(yīng)前發(fā)生自連，將會造成堿基重復(fù)，故會發(fā)生插入同一堿基的突變的失敗序列。
對于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認(rèn)為是堿基不能100%脫保護(hù)，即引物上可能含有殘留保護(hù)基團(tuán)，通常發(fā)生在G轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體2,6-diaminopurine（脫嘌呤），DNA復(fù)制和PCR過程中DNA聚合酶將2,6-diaminopurine看作堿基A，發(fā)生G到A的轉(zhuǎn)換，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基G-A置換。脫嘌呤現(xiàn)象在富含嘌呤的引物中發(fā)生的頻率較高。
引物合成過程中，造成堿基缺失，插入，置換突變的因素客觀存在，上述各種原因產(chǎn)生的失敗序列可通過純化不同程度地得到去除。但是基于目前大規(guī)模生產(chǎn)的純化方法，還不能達(dá)到100%的純度，對40 mer以下的DNA制品，HPLC是好的純化方法，其次是ULTRA PAGE；而對40 mer以上的DNA制品ULTRAPAGE純化要優(yōu)于單純的HPLC純化。所以，如您要對PCR產(chǎn)物克隆后測序，一定要選擇ULTRA PAGE純化或HPLC純化的引物。
測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是40個(gè)堿基以下的引物, 發(fā)生的概率不大，但是偶爾也會發(fā)生。客戶一般可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列復(fù)制到合成儀的，人為造成的序列出錯(cuò)可能微乎其微。在目前的技術(shù)水平下，各家公司還沒有辦法*解決引物合成出錯(cuò)的這個(gè)問題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機(jī)器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國公司提供的，所以每個(gè)合成服務(wù)商遇到的問題也基本類似，沒有哪家公司可以*避免。
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